Avhandling - Dissertation Kersti Alm Polyamines are involved in the regulation of S phase and DNA synthesis Bilden ovan visar odlade celler vars DNA märkts in med bromodeoxyuridin. Den gröna färgen markerar inmärkning i kärnor under S-fasen, den period då nytt DNA syntetiseras. S1, S2 och S3 är olika stadier under S-fasen.  Svensk populärvetenskaplig sammanfattning nedan. The figure above shows different replicon cluster patterns found in S phase cells. Cells in culture have been labelled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdUrd) for 30 minutes. The BrdUrd has then been detected by immunocytochemistry. BrdUrd is found in the cell nuclei, showing the organization of replicon clusters during the labelling period. The BrdUrd labelling, and thereby the organization of replicon clusters, follows very distinct patterns during S phase. In early S phase (S1), small fluorescent spots are found in the nucleus. The presence of non-fluorescent areas indicate that replication has not been initiated everywhere. In mid S phase (S2), the fluorescent spots are evenly distributed over the nucleus. In late S phase (S3), the fluorescent spots are larger and they are irregularly spread in the nucleus.  English abstract below. List of included articles below.   Polyamines are involved in the regulation of S phase and DNA synthesis Our research group has previously shown that treatment with the polyamine biosynthesis inhibitors alfa-difluoromethylornithine (DFMO) or amidinoindan-1-one 2'-amidinohydrazone (CGP 48664) inhibited S phase progression before any other cell cycle phase was affected. The present study was undertaken to further investigate the role of polyamines in the regulation of S phase progression and DNA synthesis. I have found that treatment with the polyamine analogue N1, N11-diethylnorspermine (DENSPM) also caused a prolongation of the S phase. The common denominator for DFMO, CGP 48664, or DENSPM treatment is a depletion of the cellular spermidine pool. CGP 48664 and DENSPM in addition deplete the spermine pool. CGP 48664 or DENSPM treatment prolonged the S phase more than did DFMO treatment. Thus, mainly spermine but also spermidine may have a function in S phase progression. Using the single cell gel electrophoresis assay, I have shown that polyamine deficiency resulted in DNA strand breaks. I have also shown that the topoisomerase II that is present in polyamine deficient cells is not functional. The results imply that there might be a change in chromatin structure rendering topoisomerase II non-functional in polyamine deficient cells. The number and organization of replicon clusters was not affected by polyamine deficiency. However, replicon clusters were less fluorescent in polyamine deficient cells compared to control cells, pointing to a lower rate of DNA elongation in the former cells. Polyamine deficiency resulted in an aberrant regulation of cell cycle progression in Chinese hamster ovary cells (CHO). The results may be related to the fact that CHO cells have a mutated p53 gene. MCF-7 cells, which have a wild type p53 gene, reacted differently to polyamine deficiency than did CHO cells. As a general conclusion of my results I suggest that normal levels of spermidine and spermine are required for an optimal rate of S phase progression and that the first cell cycle phase affected by polyamine biosynthesis inhibition is the S phase. I do believe that many of the effects observed after more than 1-2 days of polyamine biosynthesis inhibitor treatment are secondary to the initial perturbances that have taken place. See list of included articles below. Entry into Lund University Dissertation Abstracts.   Svensk populärvetenskaplig sammanfattning För att celler ska kunna växa och dela sig behöver de många olika ämnen, till exempel vitaminer, mineraler och polyaminer. Polyaminer finns i alla celler och de krävs för att cellerna ska kunna dela eller specialisera sig. Cellerna kan både själva tillverka polyaminer och ta upp dem från omgivningen. I mänskliga celler finns framför allt de tre polyaminerna putrescin, spermidin och spermin. Spermin upptäcktes av Antony van Leeuwenhoek i slutet av 1600-talet och spermidin och putrescin upptäcktes i slutet av 1800-talet. Inte förrän under senare hälften av 1900-talet har man börjat förstå polyaminernas egentliga funktion i cellen. Den här avhandlingen handlar om hur polyaminerna påverkar cellers tillväxt och delning. När celler växer och delar sig följer de ett mycket välreglerat förlopp. Cellernas livsförlopp är cykliskt och kallas därför cellcykeln. Cellcykeln delas upp i fyra faser. Cellcykelns längd varierar från några timmar till flera dagar, beroende på celltyp. Om cellerna får signalen att inte dela sig hejdas de först i G1. Därefter går cellerna in i ett tillstånd som kallas G0, där de sägs vara vilande. Andra forskare har visat att polyaminbrist påverkar cellcykeln på flera olika sätt. Mina resultat visar att polyaminbrist påverkar cellernas S-fas innan någon annan cellcykelfas är påverkad. Det finns flera möjliga förklaringar. Det kan bland annat bero på att reglermekanismerna för cellcykeln är påverkade, att något av alla de proteiner som är inblandade i DNA-syntesen är påverkat eller att DNA:t i sig är påverkat av polyaminbristen. Eftersom tidigare undersökningar inte tydligt har visat vilken av förklaringarna som är mest sannolik har jag försökt undersöka alla tre aspekterna. Jag har kommit fram till följande: Efter bara några timmars behandling med hämmare av polyaminsyntesen tar det längre tid för cellen att gå igenom S-fasen. Det beror förmodligen på att själva DNA-syntesen är påverkad. Brist på polyaminer påverkar övriga cellcykelfaser efter längre tid än en dag. Ett av proteinen som är inblandat i DNA-syntesen påverkas inte direkt av polyaminbrist, men redan efter en dags polyaminbrist kan det inte längre utöva sin funktion i cellen. Brist på polyaminer gör att DNA:t får skador, dvs det sker en direkt påverkan på DNA. Även detta inträffar efter en dags polyaminbrist. Med ovanstående resultat som grund skulle jag vilja dra följande slusatser: Polyaminbrist påverkar först DNA-syntesen, vilket leder till att det tar längre tid för cellerna att ta sig igenom S-fasen. Detta skulle kunna bero på de DNA-skador vi sett och/eller funktionsstörningen av det DNA-syntesprotein vi studerat. Det skulle vara intressant att följa upp mina resultat genom att undersöka DNA-strukturen i celler med polyaminbrist. Ämnen som kan påverka hur celler växer och delar sig är intressanta för cancerforskningen. Många ämnen som hämmar cellernas polyamintillverkning undersöks nu med avseende på deras cancerhämmande förmågor. Polyaminhämmare används också för att bota afrikansk sömnsjuka.   List of included articles The organization of replicon clusters is not affected by polyamine depletion Kersti Alm and Stina M. Oredsson Accepted for publication in J. Biol. Struct. Topoisomerase II is non-functional in polyamine-depleted cells Kersti Alm, Pia Berntsson and Stina M. Oredsson J. Cell. Biochem. 75:46-55 (1999) Polyamine deficiency and the induction of DNA strand breaks Kersti Alm, Pia S. H. Berntsson and Stina M. Oredsson Manuscript Polyamine deficiency results in abnormal regulation of cell proliferation during serum starvation Kersti Alm, Cecilia Hegardt, Jan O. Fredlund, Martin Kanje and Stina M. Oredsson Submitted Treatment of CHO cells with the polyamine analog N1, N11-diethylnorspermine retards S phase progression within one cell cycle Kersti Alm, Pia S. H. Berntsson, Debora L. Kramer, Carl W. Porter and Stina M. Oredsson Accepted for publication in Eur. J Biochem.    To the Dept of Animal Physiology Home Page Till Zoofysiologens hemsida Information valid April 8, 2000 Home